表达产肠毒素性大肠杆菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体的免疫学评价

【摘要】背景：产肠毒素性大肠杆菌(IEnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)是全球性的引起新生犊牛、羔羊和新生仔猪/断奶仔猪严重水样腹泻的主要病原,给畜牧业造成巨大损失。在发展中国家,ETEC也是引起儿童和旅游者腹泻的重要病原,成为人类公共卫生安全的重要威胁。黏附素(Adhesion)和肠毒素(]Enterotoxins)作为ETEC两类主要毒力因子通常作为产肠毒素性大肠杆菌疫苗研究的优势抗原。腺病毒因其具有安全性好、感染能力强、蛋白表达量高等优点,已成为新型疫苗的理想载体[9]。目前利用腺病毒载体疫苗对肠道传染病的免疫效果研究还未见详细报道,尤其在预防由ETEC引起的新生动物腹泻的重组腺病毒载体疫苗免疫学评价方面尚未见报道。目的：对表达产肠毒素性大肠杆菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒载体Ad.STa-K99(实验室前期构建并命名)进行扩增、纯化,并对其进行免疫学评价研究。方法：将重组腺病毒Ad.STa-K99侵染293细胞进行扩增,随后经CsCl密度梯度离心进行纯化,分别通过肌肉注射、腹腔注射及灌胃免疫小鼠。同时,克隆ETEC肠毒素STa及粘附素K99融合基因STα-K99,利用原核表达载体表达融合抗原蛋白STa-K99。采用ELISA法分别检测血清中特异性IgG、肠灌洗液中sIgA抗体、脾脏淋巴细胞增殖活性水平及CD4+、CD8+T淋巴细胞分型比值；并通过动物攻毒保护试验对其免疫效果进行评价。对攻毒后小鼠肠组织进行病理学切片观察。结果：(1)成功扩增、纯化了重组腺病毒Ad.STa-K99,病毒滴度测定结果表明重组腺病毒感染效率较高,生物活性较好。(2)通过原核表达载体成功表达了融合抗原蛋白STa-K99,SDS-PAGE、WesternBlot及ELISA鉴定结果与预期相符。(3)动物免疫实验结果显示免疫后小鼠特异性IgG、sIgA抗体及脾脏淋巴细胞增殖活性水平显著升高,CD4+/CD8+值显著增大。(4)动物攻毒保护实验结果表明,通过腹腔注射、肌肉注射及灌胃免疫小鼠免疫保护率分别达到67%、70%及80%。(5)病理学切片观察结果表明,Ad.STa-K99免疫小鼠肠组织与粘膜均完好,微绒毛形态完整,而对照组小鼠微绒毛脱落,肠粘膜严重损伤。结论：(1)Ad.STa-K99可以通过肌肉注射、腹腔注射及灌胃方式免疫小鼠,刺激机体产生较高水平的体液免疫、细胞免疫和肠道局部粘膜免疫反应,有效保护小鼠机体免受产肠毒素性大肠杆菌强毒株的侵害,安全性良好。(2)三种免疫途径中,灌胃免疫效果最好,肌肉注射较好,腹腔注射效果一般。
【作者】包少文；
【导师】邓光存；
【作者基本信息】宁夏大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】产肠毒素性大肠杆菌；腺病毒载体；耐热性肠毒素；黏附素；

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